【人物与科研】清华大学药学院唐叶峰课题组Organic Letters：桥头烯烃介导的张力驱动的生物正交反应

导语

生物正交反应是一类能够生理环境中进行、不干扰任何正常生物学过程的特殊有机化学反应。目前，生物正交反应作为一种新兴的技术手段，已经被广泛应用于生物学研究中，为研究目标分子所参与的复杂生物学过程及其调控机制提供了有力支持。近日，清华大学药学院唐叶峰教授课题组发展了一种桥头烯烃介导的新型张力驱动的生物正交反应，相关成果以“Bridgehead Alkene-Enabled Strain-Driven Bioorthogonal Reaction”为题发表在Organic Letters上（DOI: 10.1021/acs.orglett.2c01895）。

前沿科研成果

桥头烯烃介导的张力驱动的生物正交反应

在目前已知的生物正交反应中，张力驱动的逆电子Diels-Alder反应（简称IEDDA反应）具有反应速率快和无需催化剂等优点，因而成为该领域最具有发展前景的生物正交工具（图1A）。从设计思路的角度来看，这类生物正交反应成功的关键在于使用具有较高张力的烯烃作为亲双烯体反应子（也称为化学报告基团），通过反应过程中释放烯烃张力实现反应自发快速地进行。从结构上看，这些张力烯烃可大致分为中环反式烯烃（I），小环烯烃（II）、和降冰片烯（III）等三类（图1A）。虽然上述张力烯烃作为化学报告基团在生物正交化学中具有较为广泛的应用，但这些张力烯烃始终存在一个固有的问题，即高反应性通常以牺牲其稳定性或生物相容性为代价，反之亦然。因此，开发一种能够在反应性和生物相容性之间取得理想平衡的新型张力烯烃一直是生物正交化学研究者的目标。
桥头烯烃（BHA，IV，图1B）作为一种特殊的张力烯烃，长期以来受到化学家们的广泛关注。早期人们一直认为：当sp²碳处在桥环中的桥头位置时，所产生的较大张力会使得BHA不能稳定存在（这一规则称为Bredt规则）。然而，在过去几十年中，各种具有一定稳定性的BHA被陆续发现，使得这一经验规则受到挑战。
唐叶峰教授课题组认为：从结构角度看，BHA（图1B，IVa-IVc）可以看作一种母环（图1B，红色部分）上带有跨环桥连结构（图1B，蓝色部分）的特殊反式中环烯烃。这一特殊的结构赋予了BHA一些独特的性质。首先，由于桥头双键的存在，BHA具有比相应的普通反式环烯烃更高的张力（例如，双环[3.3.1]壬-1-烯（IVc）的烯烃张力为25.5 kcal/mol，高于1-甲基反式环辛烯的17.85 kcal/mol），因而BHA在环加成反应中能够表现出更高的反应活性。其次，由于反式双键被锁定在了桥环结构中，因此BHA比普通反式环烯烃更不利于发生顺-反式异构化，因而BHA具有更好的稳定性。第三， BHA在酸性条件下对亲核试剂还表现出与普通反式环烯烃相当的稳定性。以上三点独特性质使BHA成为一种性能优秀的特殊张力烯烃，既能提高普通反式环烯烃的反应性，又保持了普通反式环烯烃的稳定性，因此为平衡IEDDA生物正交反应中张力烯烃反应性与稳定性提供了可能。然而，这种潜力在生物正交化学研究中从未被探索过。

图1A）：张力驱动的IEDDA反应；B) 桥头烯烃的基本结构及主要特点；C) 石竹烯衍生的学报告基团在生物正交反应中的应用（来源：Organic Letters）

唐叶峰教授课题组一直致力于发展“自然启发”的新型生物正交反应。2018年，该团队报道了一个使用官能团化的β-石竹烯衍生物作为化学报告基团的生物正交反应（图1C）（Bioconjugate. Chem. 2018, 29, 2287-2295）。虽然β-石竹烯介导的生物正交反应具有原料易得、生物兼容性好等优点，但仍然存在反应速率较慢的问题。为解决这一问题，在本项工作中，作者以β-石竹烯1为原料，通过新颖的骨架重排反应生成具有双环-[4.3.1]-癸-1-烯骨架的高张力BHA 2；在此基础上，系统探索了BHA在生物正交化学中的应用潜力，并开发出第二代天然产物启发的生物正交反应，为解决张力烯烃固有的反应性和生物兼容性之间的平衡问题提供了一种新的研究思路。
在具体的工作中，作者首先参考文献已报道的方法，以β-石竹烯1为原料，通过Hg（II）促进的骨架重排反应实现了模型化合物BHA 2的大量制备（图2）。

图2：模型化合物2的制备（来源：Organic Letters）

随后，作者进行了模型反应研究。为了直接比较BHA 2和β-石竹烯1的反应性，作者在相同条件下平行地进行了BHA 2和β-石竹烯1与四嗪3的IEDDA反应。结果发现：BHA 2与四嗪3的反应时间相比β-石竹烯1有大幅缩短。与此同时，作者还通过计算化学手段对化合物1和2发生IEDDA反应的活化吉布斯自由能进行了研究，发现化合物2与四嗪3发生IEDDA反应的活化吉布斯自由能（ΔG^#）为18.46 kcal/mol，明显低于与1的19.86 kcal/mol，与实验结果相一致，也进一步说明BHA的IEDDA反应活性高于相应的普通反式环烯烃。此外，该反应在PBS缓冲液中也能顺利进行，表明其作为生物正交反应的应用潜力。

图3：β-石竹烯1、BHA 2与四嗪3的IEDDA反应模型研究（来源：Organic Letters）

受到这一初步结果的鼓舞，作者开始尝试对化合物2进行官能团化，以便将其开发成适用于生物学研究的化学报告基团。官能团化的过程同样以β-石竹烯1为原料，通过如图3所示的三步转化可以26%的总收率得到BHA 2的羟甲基衍生物BHA 8。作为一种化学性质稳定的固体，BHA 8可长期储存，使用方便，实用性好。最后，BHA 8可进一步转化为琥珀酰亚胺（NHS）酯BHA 9，后者在后续生物学研究中可用于对生物大分子的修饰。

图4：官能团化BHA的合成（来源：Organic Letters）

此外，作者还通过反应动力学实验，确定了BHA 8与四嗪3的IEDDA反应二级速率常数（K₂）为1.34 M⁻¹ s⁻¹（MeOH: PBS = 9:1, 20 ℃），比相应的β-石竹烯羟甲基衍生化合物（K₂= 9 × 10^-2 M⁻¹ s⁻¹, MeOH:PBS = 9:1 , 20 ℃）高约15倍。
在应用于生物标记实验之前，作者对化合物8的稳定性进行了评估。结果表明，该化合物在各种模拟生理环境下均具有较好的稳定性。同时，作者还评估了化合物9的细胞毒性。结果表明，9在较高浓度下（500 μM）对受检细胞系没有明显毒性。
在对BHA的反应性、稳定性和细胞毒性进行了系统地评估之后，作者对BHA介导的IEDDA反应在生物标记实验中的应用进行了研究。首先，作者选择牛血清白蛋白（BSA）作为模型蛋白，将该反应用于蛋白质的荧光标记。结果表明：BHA修饰BSA经荧光探针10处理后显示出随标记时间的延长而逐渐增强的荧光信号。与此同时，作者还评估了在不同浓度荧光探针条件下的标记反应效率，结果表明荧光强度在1-25 µM的范围内与荧光探针10的浓度呈正相关，并在25 µM时达到平台（图5）。

图5：通过BHA介导的IEDDA反应对蛋白质进行体外水平的荧光标记（来源：Organic Letters）

单克隆抗体介导的预标记-成像实验是检验生物正交反应适用性的常用方法。近年来，程序性死亡受体1（PD-1）及其配体（PD-L1）成为了免疫治疗的热门靶点。因此，作者选择过表达PD-L1的小鼠结肠癌细胞（MC-38）作为标记载体，进行了细胞水平的预标记-荧光成像实验。结果显示：MC-38细胞经BHA修饰的单克隆抗体Avelumab孵育后用荧光探针11处理可显示出强烈的近红外荧光（图6）。进一步的荧光定量分析表明，荧光强度还随着标记时间和探针浓度的增加逐渐增强。以上结果共同表明BHA介导的IEDDA反应在细胞标记实验中的有效性。同时，荧光信号的强弱也能够为检测细胞中PD-L1的表达水平提供可视化的参考。

图6：通过单克隆抗体介导的预标记成像实验对MC-38细胞进行的荧光标记

综上所述，作者在本文工作中探索了桥头烯烃在生物正交化学中的应用潜力。作者将一种源于天然产物的桥头烯烃开发为生物正交反应报告基团，并证明了该张力烯烃能够在反应性和生物相容性之间取得理想的平衡。进一步，作者还将该桥头烯烃介导的生物正交反应成功应用于蛋白体外荧光标记和活细胞荧光标记。本项工作不仅丰富了现有的生物正交反应工具箱，也为进一步开发桥头烯烃的应用价值提供了新的切入点。
该项工作主要由清华大学药学院唐叶峰课题组研究生谢发扬和杜娟娟课题组研究生江浩林共同完成，理论计算部分由唐叶峰课题组研究生张靖阳完成，唐叶峰教授和杜娟娟教授为通讯作者。该研究工作得到了国家自然科学基金（21971140）和北京市自然科学基金（M21011）的资助。

原文（扫描或长按二维码，识别后直达原文页面）：

唐叶峰教授课题组简介

课题组主要研究方向为“天然产物导向的合成化学、化学生物学和药物化学”，即以具有重要生物功能的天然产物分子为研究对象，通过仿生策略和合成方法学的有机结合，实现目标分子的快速、高效和多样性合成，并将其应用于药物化学和化学生物学研究。课题组自2010年成立以来，已在Cell. Res.、Acc. Chem. Res.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Sci., Org. Lett.等国际知名期刊上发表SCI论文近60篇。课题组目前有在读博士生9名。

关于人物与科研

今天，科技元素在经济生活中日益受到重视，中国迎来“科学技术爆发的节点”。科技进步的背后是无数科学家的耕耘。在追求创新驱动的大背景下，化学领域国际合作加强，学成归国人员在研发领域的影响日益突出，国内涌现出众多优秀课题组。为此，CBG资讯采取1+X报道机制，携手ChemBeanGo APP、ChemBeanGo官博、CBG资讯公众号等平台推出“人物与科研”栏目，走近国内颇具代表性的课题组，关注研究、倾听故事、记录风采、发掘精神。欢迎来稿，详情请联系C菌微信号：chembeango101。

CBG资讯一直致力于追踪新鲜科研资讯、解读前沿科研成果。如果你也对科研干货、高校招聘、不定期福利（现金红包、翻译奖励、实验室耗材优惠券等）有兴趣，那么，请长按并识别下图二维码，添加C菌微信（微信号：chembeango101），备注：进群。
●浙江大学史炳锋教授课题组ACS Catalysis：氢键辅助Ir(III)催化不对称碳氢键活化合成手性亚砜亚胺●河南师范大学张贵生教授和张兴杰老师团队OL：镍催化NN2 pincer配体促进的氨基酸衍生物脱氨联烯化反应研究
●中山大学胡文浩课题组Science China Chemistry：手性铑催化的不对称羟基叶立德Aldol型捕捉反应